ISOLASI DNA DARAH (WHOLE BLOOD) UNTUK MEMERIKSA GEN SRY
Disusun untuk Memenuhi Tugas
Matakuliah Epidemiologi Genetika dan Biomolekuler
Oleh:
ELYA SANTI 11151010000101
FIEKI AMALIA 11151010000067
SUCI MAULIDYA 11141010000089
PEMINATAN EPIDEMIOLOGI
PROGRAM STUDI KESEHATAN MASYARAKAT
FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2018 M/ 1440 H
LAPORAN PRAKTIKUM
ISOLASI DNA DARAH (WHOLE BLOOD) UNTUK MEMERIKSA GEN SRY
A.
PENDAHULUAN
Gangguang perkembangan
seks atau dikenal dengan istilah Disorders
of Sex Development (DSD) merupakan kondisi kongenital dimana terjadi
ketidakjelasan perkembangan seks atau jenis kelamin yang dinilai dari keadaan
kromosom, gonad, maupun anatomi saluram urogenital. Identifikasi jenis kelamin
dapat menggunakan beberapa metode yang dilakukan antara lain melalui
karakteristik morfologi, metode morfometrik (pengukuran), pemeriksaan
histologis, serta pemeriksaan analisis DNA. (Erawati, Winarni,
Juniarto, Santosa, & Faradz, 2011)
Penentuan jenis kelamin
dapat menggunakan metode DNA memiliki tingkat akurasi yang lebih baik, molekul
DNA merupakan pilihan untuk analisis forensik sebab bersifat stabil dan
sensitif. Salah satu teknik biologi molekuler yang digunakan untuk penentuan jenis
kelamin adalah dengan polymerase chain
reaction (PCR). PCR dapat membantu menggandakan penanda identifikasi bahkan
dengan sampel yang sangat sedikit. Beberapa penanda tipe jenis kelamin yang
digunakan pada identifikasi berbasis DNA diantaranta yaitu amelogenin, SRY, dan
Y-STRs. (Syafitri &
Auerkari, 2013)
Gen SRY yang terletak pada
lengan pendek kromosom Y menyebabkan produksi faktor-faktor transkripsi SRY
yang dengan bantuan gen-gen di luar kromosom Y yang memacu gonad
berdiferensiasi menjadi testis. (Erawati et al.,
2011). Sek-determining region (SRY) merupakan gen yang berperan dalam
perkembangan karakteristik pria. Gen sry berlokasi pada lengan pendek (p)
kromosom Y pada posisi 11.3 terdiri dari satu ekson yang mengkode 204 asam
amino. SRY pada kromosom Y menyebabkan embrio berkembang sebagai pria. Deteksi
rangkaian SRY akan membedakan samepl DNA pria dan sampel DNA wanita. Pada
penelitian terbaru dalam aplikasi analisis SRY menggunakan sel epitel yang
diekstraksi dari akrilik gigi tiruan sebagai sampel DNA untuk determinasi jenis
kelamin dan hasil menunjukkan keberhasilan dalam deteksi dan kuantifikasi DNA. (Syafitri &
Auerkari, 2013)
B.
ALAT DAN BAHAN
1.
Alat:
a.
Gloves
b.
Spuit disposable
c.
Tourniquet
d.
Microcentrifuge tube 1,5 ml
e.
Micropipet ukuran 100-1000µl dan Tip biru
f.
Micropipet ukuran 10-100µl dan Tip
kuning
g.
Tip Putih
h.
Vortex
i.
Sentrifuge
j.
Microsentrifugator
k.
Water bath
l.
Vaccuteiner darah
m.
Mesin PCR
n.
Nanodrop
o.
Chamber elektroforesis
p.
Tray elektroforesis
q.
Sisir
r.
Power supply
s.
Spidol
t.
GS Column
u.
Tisu
v.
kapas
2.
Bahan:
a.
Alcohol 70%
b.
Sampel darah vena 300µl
c.
Lisis buffer
d.
GB Buffer
e.
Wizzar genomic DNA purification
(Promega)
f.
Isopropanol
g.
Etanol Absolut
h.
Larutan W1 buffer
i.
Larutan wash buffer
j.
Larutan elusi buffer
k.
Aquades
l.
Primer upstream dan primer down
stream
m.
DNA rantai ganda hasil isolasi
n.
Enzim DNA Polymerase
o.
Deoxynucleotida yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP
p.
Larutan buffer dan garam
sebagai sumber ion
q.
Larutan hasil isolasi DNA dan
larutan hasil PCR
r.
Marker DNA
s.
Larutan TAE 1X (Tris base,
glacial acetic acid, dan EDTA)
t.
Agarosa bubuk
u.
Sampel buffer (loading
buffer), larutan stok loading buffer 6x dibuat dari 0,25% bromofenol
blue dan 40% sukrosa dalam akuades
v.
Etidium bromide
C.
CARA KERJA
C.
1. Pengambilan sampel darah
vena
1.
Persiapkan alat-alat yang
digunakan untuk mengambil sampel darah vena.
2.
Gunakan sarung tangan untuk
melindungi diri.
3.
Responden diminta untuk
meluruskan lengannya, kemuudian minta responden untuk mengepalkan tangannya.
4.
Pasang tourniquet di
lengan responden.
5.
Pilih bagian median cubital,
basilica, atau caphalica lalu lakukan perabaan untuk memastikan
posisi vena.
6.
Bersihkan kulit pada bagian
yang akan diambil darah dengan kapas serta alcohol 70% dan biarkan kering.
7.
Tusuk bagian vena menggunakan spuit
hingga darah masuk kedalam spuit dan memenuhi.
8.
Letakan kapas kering ditempat
suntikan kemudian lepaskan tourniquet dan segera lepaskan jarum.
C.
2. Isolasi DNA
1.
Siapkan tabung mikrosentrifuge
dan beri nomor dengan menggunakan spidol.
2.
Ambil Micropipet ukuran
100-1000µl dan tip biru
kemudian pipet sebanyak 900µl
lisis buffer kemudian masukkan kedalam tabung mikrosentrifuge.
3.
Ambil Micropipet ukuran
100-1000µl dan tip biru
kemudian pipet sebanyak 300µl
darah kemudian masukkan kedalam tabung mikrosentrifuge yang berisi lisis
buffer.
4.
Inkubasi dengan cara bolak
balikan tabung yang berisi darah dan lisis buffer untuk menghomogenkan pada
suhu kamar selama 10 menit.
5.
Masukkan tabung mikrosentrifuge
kedalam mesin sentrifuse. Lakukan sentrifuse selama 5 menit dengan
kecepatan 3000 rpm. Hal ini dilakukan untuk mendapatkan pellet dari sampel
darah.
6.
Setelah dilakukan sentrifuse
maka akan didapatkan supernatant dan pellet. Lalu buang supernatan namun jangan
sampai pellet ikut terbuang.
7.
Ambil Micropipet ukuran
100-1000µl dan tip biru
kemudian pipet sebanyak 100µl
larutan lisis buffer kedalam tabung mikrosentrifuge yang berisi pellet. Kemudian
bolak-balikan tabung
8.
Ambil Micropipet ukuran
100-1000µl dan tip biru
kemudian pipet sebanyak 200µl
larutan GB Buffer kedalam tabung mikrosentrifuge. Hal ini dilakukan untuk
denaturasi protein.
9.
Inkubasi pada suhu 60oC
selama 10 menit. Setelah diinkubasi dinginkan di suhu ruang.
10. Ambil Micropipet ukuran 100-1000µl dan tip biru kemudian pipet sebanyak 200µl larutan etanol absolut kedalam tabung microsentrifuge yang telah
diinkubasi kemudian vortex sebentar.
11. Pindahkan larutan dari tabung mikrosentrifuge kedalam tabung
mikrosentrifuge dengan GS Column (dengan saringan).
12. Lakukan sentrifuse selama 5 menit dengan kecepatan 14000 rpm.
Setelah itu buang cairan.
13. Ambil Micropipet ukuran 100-1000µl dan tip biru kemudian pipet sebanyak 400µl larutan W1 Buffer ke dalam tabung untuk melarutkan protein yang
terjebak di tabung GS Column.
14. Lakukan sentrifuse dengan kecepatan 14000 rpm selama 1 menit.
Setelah itu buang cairan yang berada ditabung mikrosentrifuge.
15. Tambahkan sebanyak 600µl larutan wash buffer
kedalam tabung mikrosentrifuge. Hal ini
bertujuan untuk membersihkan semua larutan yang telah dimasukan dan hanya
menyisakan DNA.
16. Lakukan sentrifuse dengan kecepatan 14000 rpm selama 1 menit. Lalu
buang cairan yang turun kedalam tabung mikrosentrifuge.
17. Lakukan sentrifuse kembali dengan kecepatan 14000 rpm selama 1
menit.
18. Setelah dilakukan sentrifuse pisahkan tabung mikrosentrifuge dengan
tabung GS column. Buang tabung mikrosentrifuge yang lama.
19. Pindahkan tabung GS column dengan tabung mikrosentrifuge baru yang
telah diberi nomer.
20. Ambil Micropipet ukuran 10-100µl dan tip kuning kemudian pipet sebanyak 50µl larutan elusi buffer kemudian diamkan selama 3 menit. Larutan
elusi buffer berguna untuk melarutkan nukleotida yang ada di tabung GS Column.
21. Setelah didiamkan selama 3 menit masukan tabung mikrosentrifuge
kedalam mesin sentrifuse, dan sentrifuse selama 1 menit dengan kecepatan 14000
rpm. Hal ini dilakukan agar nukleotida turun ke dasar tabung mikrosentrifuge.
22. Keluarkan tabung mikrosentrifuge dari mesin sentrifuse lalu pisahkan
tabung mikrosentrifuge dengan tabung GS Column, lalu buang tabung GS Column dan
simpan tabung mikrosentrifuge yang terdapat sampel DNA kedalam lemari
pendingin.
C.
3. Mereplikasi segmen DNA dengan Teknik PCR
1.
Buatlah campuran untuk PCR
dalam suatu tabung PCR yang terdiri dari 10x larutan buffer sebanyak 2,5 µl; larutan campuran nukleotida dNTP 12,5mM
sebanya 0,5 µl; primer up stream
(100pmol/ml) sebanyak 0,5 µl;
primer down stream (100pmol/ml) sebanyak 0,5
µl; enzim DNA polymerase (5unit/ µl) sebanyak 0,25
µl; larutan hasil isolasi DNA (sebagai cetakan)
sebanyak 1 µl; dan air hasil
destilasi dan sterilisasi sebanyak 20,75
µl. hingga didapatkan total volume 25 µl.
2.
Campurkan semua larutan
tersebut menggunakan vortex untuk menghomogenkan larutan.
3.
Program mesin PCR dengan profil
35 siklus.
4.
Letakkan tabung reaksi PCR pada
mesin PCR dan jalankan sesuai program.
5.
Setelah selesai, keluarkan
tabung reaksi PCR dari dalam mesin, maka DNA hasil amplifikasi siap dianalisis.
C.
4. Pengecekan konsentrasi dan kontaminasi
1.
Siapkan mesin nanodrop.
2.
Ambil cairan aquades dengan
menggunakan micropipet dan tip berwarna putih lalu teteskan pada mesin
nanodrop, kemudian tempelkan tisu yang dibasahi oleh tetesan aquades.
3.
Ambil micropipet dan tip
berwarna putih, lalu pipet sebanyak 0,1µl larutan DNA.
4.
Teteskan larutan DNA pada mesin
nanodrop dengan hati-hati. Kemudian lakukan pengukuran konsentrasi dan
kontaminasi. Catat hasil yang muncul.
C.
5. Elektroforesis DNA
1.
Buat media agar dengan menimbang
terlebih dahulu agarosa bubuk untuk membuat 1,5% gel agarosa dalam larutan TAE.
2.
Kemudian masak larutan agarosa
sampai mendidih dan larut.
3.
Kemudian biarkan larutan dingin
sampai kira-kira 70oC, kemudian masukkan 5µl 0,1% etidium bromide.
4.
Tuangkan larutan agarosa
tersebut ke dalam tray elektoforesis yang sudah dipasangi sisir.
5.
Biarkan agarosa dingin dan
mengeras.
6.
Selanjutnya siapkan larutan DNA
dengan loading buffernya dengan komposisi 1 µl loading buffer ditambah 5 µl larutan DNA.
7.
Setelah agar mengeras,
pasangkan tray berikut isinya ked lam chamber elektoforesis.
Ambil sisir pada gel. Kemudian tuang larutan TAE sampai melebihi permukaan gel.
8.
Masukkan larutan loading
buffer dan DNA ke dalam sumur yang telah terbentuk dri sisir yang telah
diangkat menggunakan micropipette secara hati-hati dan perlahan.
Pastikan ujung tip sudah sedikit masuk pada sumur media agar.
9.
Nyalakan mesin elektroforesis
selama 1 jam.
10. Matikan mesin dan keluarkan media agar dengan hati-hati pada tray
yang disediakan.
11. Amati pita-pita yang terbentuk dengan menggunakan UV Iluminator
kemudian dokumentasikan dengan kamera polaroid.
D.
HASIL
·
Hasil
pengukuran konsentrasi DNA
 |
Dari pengukuran yang
dilakukan menggunakan alat nanodrop, diketahui bahwa sampel memiliki konsentrasi
DNA sebesar 22.960 ng/µL, sedangkan kemuniannya
(purity) sebesar 1.43 (260/280). Dari
hasil tersebut menggambarkan konsntrasi DNA cukup baik walaupun terdapat
kontaminasi pada sampel ini yang ditandai dengan tanda seru pada samping kolom purity. Walaupun terdapat kontaminasi
pada sampel namun, konsentrasi sampel cukup baik. Sehingga hasil sampel masih bisa
menunjukkan hasil yang baik.
·
PCR SRY
Hasil dari
elektroforesis menunjukkan bahwa sampel 1, 3, 5 dan 7 merupakan jenis kelamin laki-laki.
Hal ini dibuktikan pada gambar diatas bahwa adanya senyawa SRY pada hasil elektroforesis.
Senyawa SRY hanya akan ditemukan pada jenis kelamin laki-laki sehingga pita
yang terang atau terlihat merupakan jenis kelamin yang cocok. Sedangkan pada sampel
2,4 dan 6 tidak muncul pita pada gambar yang artinya bahwa pita pada sampel
dengan jenis kelamin perempuan tidak akan muncul jika diberikan dengan senyawa
SRY begitu juga sebaliknya.
E.
PEMBAHASAN
Seseorang
yang dikatakan sebagai seorang wanita memiliki gonosom XX dan seorang pria
memiliki gonosom XY. Setiap kromosom terdiri dari beberapa lokus dimana dalam
lokus tersebut terdapatlah gen. Pada mamalia, gen SRY yang terdapat pada
kromosom Y mempengaruhi ekspresi sifat laki-laki pada mamalia tersebut, sedangkan
gen dosage-sensitive sex-reversal, adrenal hypoplasia congenital, X chromosome
(DAX1) pada kromosom X mempengaruhi ekspresi sifat perempuan.2,3 Ekspresi gen
SRY menyebabkan terekspresikannya gen-gen yang lain yang meningkatkan
perkembangan laki-laki. Gen SRY mengkode protein yang mengandung DNA-binding
domain yang disebut High Mobility Group box (HMG box).
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik
perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik
yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan
sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang
urutannya komplemen dengan DNA templatnya. Proses tersebut mirip dengan proses
replikasi DNA secara in vivo yang bersifat semi konservatif (Giri 2004).
PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA antara dua
primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke dalam sel
(in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi sebagai
cetakan (templat) yang mengandung DNA-target (yang akan di amplifikasi) untuk
pembentukan molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat
(dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua
primer akan mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang
terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut
akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3’.
Setelah kedua primer menempel pada DNA templat, DNA
polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan
nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida templat. DNA polimerase
mengkatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3’ dengan
gugus 5’ fosfat dNTP yang ditambahkan. Sehingga proses penambahan dNTP yang
dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 5’→3’ dan
disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP
yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA templat
(Campbell 2002).
PCR melibatkan banyak siklus yang masing-masing
terdiri dari tiga tahap berurutan, yaitu pemisahan (denaturasi) rantai DNA
templat, penempelan (annealing) pasangan primer pada DNA target dan pemanjangan
(extension) primer atau reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh DNA
polimerase(Giri 2004).PCR merupakan suatu teknik perbanyakan molekul DNA dengan
ukuran tertentu secara enzimatik melalui mekanisme perubahan suhu. Secara
ringkas, prinsip PCR dapat dijelaskan sebagai berikut. Pada suhu 94-95oC, DNA
mengalami denaturasi (pembelahan untai ganda menjadi untai tunggal). Waktu yang
diperlukan untuk proses ini sekitar 30 detik pada suhu 95oC atau 15 detik pada
suhu 97oC. Apabila DNA target mengandung banyak nukleotida G/C, suhu denaturasi
dapat ditingkatkan. Denaturasi yang tidak lengkap akan menyebabkan renaturasi
secara cepat, sedangkan waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mempengaruhi
enzim taq polymerase. Hal ini sangat berpengaruh terhadap keberhasilan proses
PCR. Umumnya sebelum proses siklus PCR dimulai sering kali dilakukan pre
denaturasi selama 3-5 menit, untuk menyakinkan bahwa molekul DNA target yang
ingin dilipatgandakan jumlahnya benar-benar terdenaturasi (Giri 2004).
F.
KESIMPULAN
Sebagai
pembawa info genetik, gen sangat berpengaruh pada penentuan jenis kelamin.
Keberadaan gen SRY mengakibatkan munculnya ekspresi sifat laki-laki pada
individu mamalia. Proses biomolekuler yang terjadi saat gen menentukan jenis kelamin
sangat kompleks, dimana satu gen utama mempengaruhi ekspresi gen-gen lainnya
yng turut berpengaruh dalam penentuan jenis kelamin.
G.
DAFTAR PUSTAKA
Erawati, M., Winarni, T. I., Juniarto, A.
Z., Santosa, A., & Faradz, S. M. H. (2011). Analisis Mutasi Gen SRY dan AZF
serta Fungsi Gonad pada Penderita 46 , XY Disorder of Sex Development ( DSD ). Jurnal
Ilmu Kedokteran, 5(1), 49–55.
Syafitri, K., & Auerkari, E. (2013).
Sex determination using histological and DNA analysis in forensic odontology. Jurnal
PDGI, 62(1), 11–16.
Komentar
Posting Komentar